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脑立体定位仪-竹节参总皂苷对不同时间段脑出血模型大鼠脑损伤的保护作用

竹节参总皂苷对不同时间段脑出血模型大鼠脑损伤的保护作用

 

闵静1,严菊华1,敖明章2( 1. 湖北职业技术学院医学院,湖北孝感432000; 2. 华中科技大学生命科学与技术学院)

 

摘要: 目的研究竹节参总皂苷( TSPJ) 对脑出血大鼠脑损伤不同时间段的影响。方法采用胶原酶法制备脑出血动物模型,将48 只大鼠随机分为假手术组、模型组、TSPJ 低、高剂量组共4 组,每组12 ; 造模后6h 灌胃给药,每12h 1 次,于造模后12、72h 测各组大鼠脑组织含水量,超氧化物歧化酶、丙二醛含量,IL-6、TNF-α 水平。结果与模型组比较,72h 高剂量TSPJ 组脑组织含水量减少,超氧化物歧化酶活性增高,丙二醛含量下降,IL-6、TNF-α 水平下降,12h 时TSPJ 高剂量组超氧化物歧化酶活性增高,TNF-α 下降; 丙二醛、IL-6 含量变化不明显。结论TSPJ 能减轻出血性脑损伤,对受损脑组织发挥保护作用,且有时间依赖性。

关键词: 竹节参总皂苷; 脑出血; 脑水含量

中图分类号: 965. 1 文献标识码: A 文章编号: 2095-4646( 2014) 03-0194-03

 

脑出血( intracerebral hemorrhage ICH) 是一种急症重症,严重威胁人们的健康; 脑出血后血凝块回缩,血脑脊液屏障的破坏,血肿周围缺血,组织炎症反应等因素都可造成脑组织的水肿,从而引起功能障碍[1]。竹节参总皂苷( total saponins ofpanax japonicus,TSPJ) 具有**化瘀作用,本实验通过观察12h 和72h 两个时间段TSPJ 对脑出血大鼠脑组织超氧化物歧化酶( SOD) 活性、丙二醛( MDA) 及IL-6、TNF-α 含量的影响,研究其不同时间段的效果及机理。

1 材料与方法

1. 1 实验动物

健康雄性SD 大鼠,体质量为240 ~ 280g,清洁级,由湖北省动物实验中心提供,合格证号:SCXK( 鄂) 2011 ~ 012; 分组: 大鼠随机分为4 组,假手术组、模型组、TSPJ 低剂量组( 100mg /kg) 、TSPJ 高剂量组( 200mg /kg) ,每组12 只,分别观察术后12、72h 两个时间点各项指标。TSPJ 组术后6h 灌胃给药,假手术组及模型对照组灌胃等量生理盐水,以后12h /次TSPJ 组灌胃给药,而假手术组及模型对照组灌胃等量生理盐水,各组饲养条件相同。

1. 2 药品与仪器

竹节三七样品采自湖北恩施,采用醇提取法,**称取样品50mg,定容于50ml 容量瓶,**吸取样品液2ml,置50ml 容量瓶中定容,摇匀。由华中科技大学生命科学院天然产物实验室通过标准品检测,TSPJ 净含量为33. 3%,用前配成悬浊液,置4℃ 冰箱保存备用。Ⅶ型胶原酶,美国Sigma公司产品; 注射用尿激酶( 批号03290,南京南大药业有限责任公司) ,配制成200 IU / L 的溶液;SOD 试剂盒、MDA 试剂盒( 上海恒远生化试剂有限公司) ; IL-6、TNF-α 试剂盒,北京福瑞生物工程有限公司。仪器: 大鼠脑立体定位仪,微量注射仪购于北京智鼠多宝生物科技有限责任公司; 电子天平( SARTOR2US,BP211D) ,德国生产; GF-D200半自动生化分析仪( 山东高密彩虹分析仪器有限公司) , 8021 离心机( 上海手术器械厂) ; 752 分光

光度仪( 上海精密仪器仪表有限公司) 。

1. 3 模型制备

参照osenberg 等[2]的方法,根据包新民大鼠脑立体定位图谱[3]确定尾状核的位置: 术前禁食,自由饮水,大鼠经****( 0. 1ml /100g) 腹腔麻醉俯卧位固定于立体定位仪上,据图谱调整立体定位仪于注射点,头皮正中常规**后矢状位切开约1. 5cm,暴露前囟点,用骨钻钻颅打孔( 直径约1mm) ,用微量进样器吸取胶原酶2ml,迅速插入已钻好孔内,进针5mm,注射时间不少于15min,留针10min 后缓慢退针,钻孔用骨蜡封闭,局部**后,缝合皮肤,假手术组注射2ml 的生理盐水,手术过程同出血组。

1. 4 检测方法

1. 4. 1 脑组织含水量测定

分别于术后第12h 及第72h,过量麻醉大鼠,快速断头取脑组织,用滤纸吸干脑表面液体和血迹,小塑料封口袋密闭全脑,电子天平称湿重,然后放入80℃烤箱中,72h 后称干重。脑含水量计算公式: [( 湿重- 干重) /湿重]× 100%。

1. 4. 2 SOD 活性、MDA 含量测定

各组动物再分两组分别于术后第12h 及第72h,过量麻醉大鼠,快速断头取脑组织,微冻硬后取出,置薄膜隔开的干冰上,分离出血侧皮质及基底节,4℃下用预冷的匀浆介质制备成10%的脑匀浆置3000r /min 离心15min 后,取上清液按试剂盒方法操作。SOD 活性测定: 通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基,进而氧化羟胺形成亚硝酸盐,在550nm 处测其吸光度,通过公式计算。MDA 含量的测定: 通过过氧化脂质降解产物中的MDA 可与硫代***酸缩合,形成红色产物,在532nm 测吸光度。

1. 4. 3 IL-6、TNF-α 测定

分别于术后第12h 及第72h 手术,取脑匀浆上清液,按放免试剂盒说明书,加入分离剂后充分混匀,放室温20min,离心,吸上清,生化分析仪上测放射性,以B /T 计算NSB、SO 结合百分率,以B /B0 计算标准及待测样品结合百分率,并查出样品值。

1. 5 统计方法

以SPSS 17. 0 统计分析,数据以珋x ± s 表示,各组间比较采用t 检验,P 0. 05 为差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 TSPJ 对脑水肿的影响

从表1 可见, 12h 时TSPJ 组脑出血后的脑组织含水量无明显影响, 72h 时高剂量组TSPJ 组脑出血后的脑组织含水量减少,和模型组比较有显著性差异( P 0. 05) 。

 

 2. 2 TSPJ 对大鼠脑组织SOD 活性、MDA 含量的影响

模型组与假手术组各时间段大鼠脑组织SOD 活性、MDA 含量差异极显著( P 0. 01 ) ;与模型组比较,TSPJ 高剂量组12h 时SOD 活性有明显差异( P 0. 05 ) ,MDA 含量无明显差异,72h 高剂量TSPJ 组SOD 活性增高,差异极显著( P 0. 01 ) ,MDA 含量下降,差异性显著( P 0. 05) ,见表2。

 

2.3 TSPJ 对大鼠脑组织中IL-6、TNF-α 含量的影响

与假手术组比较,模型组大鼠IL-6、TNF-α 水平增高,差异有非常显著性( P 0. 01) ; 与模型组比较,12h 时低剂量组IL-6 无明显差异,高剂量组TNF-α 有差异( P 0. 05) ,72h 时高剂量TSPJ 组大鼠IL-6、TNF-α 水平下降( P 0. 05) ,见表3。

 

 3 讨论

在脑出血的病理发展过程中,脑组织的继发性损伤是脑出血病情加重、预后不佳的主要因素[4]。出血性脑损伤的炎性反应,由白细胞粘附血管,血-脑屏障遭破坏,炎性细胞侵入脑实质等组成。脑出血时炎性因子表达增加,增加脑水肿、血管壁通透性、炎细胞浸润。IL-6 介导白细胞与内皮细胞粘附,TNF-α 能促进中性粒细胞浸润并释放蛋白水解酶,与神经元损害密切相关[5]。实验中可以看出TSPJ 组脑出血后的脑组织含水量减少,与模型组有显著性差异( P < 0. 05) ; 并且72h 时TSPJ 组大鼠脑组织丙二醛含量降低( P <0. 05) ,超氧化物歧化酶的活力增高,高剂量TSPJ组极明显( P < 0. 01) , 72h 时高剂量TSPJ 组IL-6、TNF-α 水平明显下降,与模型组有显著性差异( P< 0. 05) ,推测脑出血12h 内,血肿中的红细胞破裂或被吞噬细胞吞噬,含铁血黄素游离,炎细胞浸润,炎症反应较明显,脑出血第72h 血肿经循环吸收**,炎性细胞数量逐渐减少,炎症因子减少,所以此时血肿变小,炎症反应减轻,超氧化物歧化酶的活力增高,丙二醛降低, IL-6、TNF-α 水平明显下降。因而72h 时效果明显除与**作用有关外,还与**不同发展阶段有关,所以****和研究还要考虑不同时间段病变区别及对药效的影响。总而言之,TSPJ 能在一定程度上减少损伤时自由基生成,抑制脂质过氧化反应,增加体内自由基**剂如超氧化物歧化酶,减少炎症因子,从而对颅脑损伤有一定保护作用。

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