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水迷宫---慢性皮质酮注射诱导焦虑性抑郁树鼩模型的研究(一)


网络出版时间: 2017  12  14 13: 50    网络出版地址: http: / / kns cnki net / kcms / detail /34 1086  20171211 1848 058 html

◇实验方法学◇

慢性皮质酮注射诱导焦虑性抑郁树鼩模型的研究(一)
吴梦瑶赵洪庆杨 琴柳 卓杜 青孟 盼韩远山王宇红



( 湖南中医药大学湖南省中药粉体与**药W省部共建国家重点实验室培育基地湖南 长沙 410208)

doi: 10. 3969 / j. issn. 1001 - 1978. 2018. 01. 029

文献标志码: A 文章编号: 1001  1978( 2018) 01  0141  05

中国图书分类号: -332; 322. 81; 347; 363-332; 749. 41;

749. 72; R977. 11

摘要: 目 探讨慢性皮质酮注射对近灵长类动物树鼩焦虑和抑郁样行为的影响并进行药W预见性评价建立新型   虑性抑郁动物模型

方法 12 只中缅树鼩随机分为正常组模型组和文拉法辛组每组 4 只采用慢性皮质酮注射( ih27 mg·kg  1 21 d) 建立焦虑性抑郁树鼩模型文拉法辛组于造模同时灌胃给药( 6 mg·kg  1 ) 采用自主活动评分糖水偏好测试Morris  水迷宫实验评价树鼩的焦虑和抑郁行为表现; ELISA 试剂盒检测树鼩血浆 CRHACTHCOR 含量; HPLC-ECD  法检测树鼩脑内海马杏仁核前额叶皮质的单胺递质 5-HTNEDA  含量

结果与正常组比较模型组树鼩自主活动评分糖水偏食度学习记忆能力均明显下  降( P  0. 01 ) 血浆 CRHACTHCOR 含量明显上升( P 0. 05) ,海马杏仁核前额叶皮质 5-HTNEDA 含量降低( P 0. 05 ) ; 文拉法辛组树鼩学习记忆能力得到改善血浆CRHCO 含量明显降低( P  0. 05) ,各脑区 5-HTNEDA 含量上升( P  0. 05) 。结论 焦虑性抑郁模型树鼩具有明显的 HPA 轴亢进及单胺递质失调现象而文拉法辛能够逆转该现象说明该焦虑性抑郁树鼩模型具有药W预见性 一种更接近人类临床的新型焦虑性抑郁动物模型

 

关键词: 焦虑; 抑郁; 树鼩; 文拉法辛; HPA 轴; 单胺递质; 皮质酮

 

焦虑性抑郁症是一种重性抑郁与焦虑共病的复合型精 神障碍J病具有精神运动迟滞致残率及自S率高社会功 能损害重预后差等特征1]大量研究表明焦虑与抑郁的 发病机制均涉及到神经递质失调2]下丘脑 垂体 肾上腺( hypothalamic- pituitary- adrenaHPA) 轴紊乱神经营养缺乏等3然而焦虑性抑郁J病的发病机制研究进展缓慢本课题组前期已建立焦虑性抑郁大鼠模型4但考虑到该复合型J病的特殊性以及啮齿类动物与人类亲缘关系的疏远性 采用常规的啮齿类动物并不能完全满足该J病的研究建立一种更能模拟焦虑性抑郁临床发病特点的合适模型对该病的防治尤为重要5]

因此本实验拟采用近灵长类动物树鼩6] 为研究对象 通过慢性皮质酮注射建立焦虑性抑郁树鼩模型研究焦虑性抑郁模型树鼩血浆促肾上腺皮质J素释放J素( corticotropin releasing hormoneCH) 皮质醇( cortisolCO促肾上腺皮质J素( adrenocorticotrophic hormone,ACTH ) 及海马杏仁核前额叶皮质的单胺递质 5-羟色胺( 5-hydroxytryptamine5- HT) 去甲肾上腺素( norepinephrineNE) 多巴胺( dopamine DA) 含量的表达情况并采用临床**该J病的一线用药文拉法辛对模型树鼩进行干预进行药W预见性研究确定模型的可行性为该病的临床防治及抗焦虑性抑郁新药的研发提供有力的实验基础

1 材料与方法

1 1    动物    CL 级中缅树鼩 12 只体质量 130  150 g购自云南昆明树鼩种质资源中心饲养于湖南中医药大学**附属医院 SPF 级实验动物中心SYXK( 湘) 2015-0003饲养于不锈钢笼具内室温( 24 ± 2) ℃ 相对湿度( 50 ± 5) % 光/ 暗周期 12 h /12 h按实验动物 3 原则给予人道关怀

1. 2    试剂与仪器     CRH、ACTH、CORT 试剂盒( 美国 R&D公司) ; 文拉法辛缓释片( 成都康弘药业) ; 皮质酮( 北京索莱宝生物公司) ; 5-HT、NE、DA 对照品( 中国药品生物制品检定所) 。Morris 水迷宫( 北京智鼠多宝生物科技公司) ; 动物行为学习记忆系统( 法国 Viewpoint 公司) ; MK-3 型酶标仪( 美国 Thermo Scientific 公司) ; 全自动匀浆机( 德国 IKA 公司) ; 1260 型高效液相色谱仪( 美国安捷伦公司) ; SDC 电化学检测器( 荷兰 Antec 公司) 。

1 3    造模及分组    12 只树鼩随机分为 3 组: 正常组模型组文拉法辛组每组 4 只正常组树鼩正常饲养; 根据文献报道的树鼩对大鼠体表换算系数7模型组树鼩每天给予皮质酮皮下注射( 27 mg·kg 1 ) ,持续 21 d; 文拉法辛组树鼩于造模同时灌胃给予药W文拉法辛( 6 mg·kg  1 1 d) 正常组和模型组给予等体积生理盐水造模完成后进行行为学测试   试完成后将动物麻醉腹主动脉取血于冷冻台上分离出大   脑海马杏仁核前额叶皮质丘脑等组织液氮中保存备用

1 4    行为学检测

1 4 1    自主活动评分    造模结束后分析树鼩的自主活动能力时间为 5 min。自主活动评分包括移动( 水平方向的位移) 和跳跃( 垂直方向的位移) ,将两者次数相加表示各组树鼩的相对活动能力

1 4 2    糖水偏好测试    各组树鼩禁水 12  h 后每笼放置 2个水盒一个装 100 mL 蔗糖水( 0. 029 mol·L  1 ) ,另一个装等量的蒸馏水测定树鼩在 6 h( 9 ∶ 00  15 ∶ 00) 内分别摄入蔗糖水和蒸馏水的体积并计算糖水偏好率( 糖水消耗体积/ 总消耗体积 × 100% ) 。

1 4 3    Morris 水迷宫实验    水槽平均划分为 ABCD 4 个象限用奶粉将水调成乳白色将平台置于水面下 2  cm使其在实验光线下对树鼩不可见于实验 d 17 开始对树鼩进行适应性训练即从平台象限的正对面将树鼩面向池壁放入   水中 75 s 内未找到平台则将其牵引至平台处停留 10 s, 每天训练 1 次持续4 d8]每次训练结束后迅速用毛巾将树鼩毛发擦干以防止树鼩低体温

定位航行实验: 训练完成后将树鼩从训练位置面向池壁放入水中观察并记录树鼩爬上平台所需时间即逃避潜伏期( escape latencyEL) 考察其学习能力

探索实验: 于实验 d 21 撤除平台由同一入水点将树鼩面向池壁放入水中记录 1 min 内树鼩在平台所在象限的停留时间( stay timeST) 考察其记忆能力

1 5    HPA 轴指标含量测定    行为学测试完成后用****钠( 40 mg·kg 1 ) 将动物麻醉腹主动脉取血收集于肝素钠管中3 000 r·min  1 离心 15 min取血浆 80℃ 保存格按照 ELISA 试剂盒说明书检测各组树鼩血浆 CRHACTHCOR 的含量

1. 6    单胺递质含量测定

1. 6 1    脑组织匀浆样本制备    取冷冻保存的海马杏仁核前额叶皮质精密称重 1 ∶ 3 比例( 杏仁核为 1 ∶ 10) 分别

加入 0. 01 mol·L 1 高氯酸溶液( 内含 0. 03 mmol·L 1 ED-TA10 μg·L  1 内标 DHBA) 于冰上进行匀浆匀浆后 4℃ 13 000 r·min 1 离心 10 min 取上清 0. 22 μm 针头过滤器过滤后进样

1 6 2    色谱条件      色谱柱: Quattro 3  C18 柱( 150  mm × 2. 1

mm,3 μm) ; 流动相: 90 mmol·L  1 单水磷酸二氢钠50 mmol·L  1 单水柠檬酸1. 7 mmol· L  1 辛烷磺酸钠50 mol

·L 1 EDTA 的混合液 甲醇( 87 ∶ 13 ) ; 流速: 0. 2 mL · min 1 ; 柱温: 35℃ ; 进样量: 20 μL。

1 6 3    标准曲线绘制    精密称取适量 5-HTNEDA 对照品溶于0. 01 mol·L 1 高氯酸溶液中配成 1 g·L 1 混合储备液取适量体积的储备液稀释成 5  个梯度浓度点从低到高依次为

3. 1256. 2512. 52550 μg·L 1 将标准品溶液由低浓度至高浓度进样进样体积20 μL对色谱峰进行积分记录峰面积以浓度为横坐标峰面积为纵坐标绘制标准曲线( Fig 1) 。

7   统计学分析   采用 SPSS 17.  0 软件进行统计分析验数据以 x± s 表示组间差异比较采用单因素方差分析 两两比较方差齐时采用 LSD 检验法方差不齐时采用 Dun- netts T3 法进行分析



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