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水迷宫-复方柴金解郁片对慢性应激抑郁大鼠HPA轴及海马单胺神经递质的影响

本文引用:韩远山,蔺晓源,易刚强,王宇红, ,赵洪庆, .复方柴金解郁片对慢性应激抑郁大鼠 HPA 轴及海马单胺神经递质的影响[J].湖南中医药大学学报,2017,37(3):240-244.

 

复方柴金解郁片对慢性应激抑郁大鼠HPA 轴及海马单胺神经递质的影响

 

韩远山 1,蔺晓源 1,易刚强 2*,王宇红 2,杨 1,孟 2,赵洪庆 2,杜 2

(1.湖南中医药大学**附属医院,湖南 长沙 410007;2.湖南中医药大学,湖南省中药粉体与****省部共建国家重点实验室培育基地,湖南 长沙 410208)

 

〔摘要 目的 研究复方柴金解郁片对慢性应激抑郁模型大鼠 HPA 轴及海马单胺神经递质的影响,探讨其可能的抗抑郁机制 方法 SD 大鼠随机分为 6 组:对照组、模型组、氟西汀组(5.4 mg/kg)、复方柴金解郁片高、中、低剂量组(2.74、1.37、

0.68 g/kg),采用慢性不可预见性温和应激建立抑郁模型,于造模同时给药,连续 28 d。采用蔗糖偏好实验和旷场测试检测大鼠的抑郁样行为,Morris 水迷宫检测大鼠的学习记忆能力,HE 染色观察大鼠海马病理结果变化,ELISA 法检测大鼠血浆促肾上腺皮质**释放**(CRH)、促肾上腺皮质**(ACTH)、皮质酮(CORT),以及海马 5-羟色胺(5-HT)、5-羟吲哚乙酸(5- HIAA)、去甲肾上腺素(NA)、多巴胺(DA)的含量 结果 与抑郁模型组比较,复方柴金解郁片组大鼠蔗糖偏嗜度及活动次数均显著提高,学习记忆能力提升,海马病理损伤情况得到缓解,血浆 CRH、ACTH、CORT 含量下降,海马组织内 5-HT、NA、DA 含量上升,5-HIAA 含量下降(P<0.05)。  结论   复方柴金解郁片能显著改善模型大鼠情绪和学习记忆功能、缓解海马组织损伤,其作用可能与抑制 HPA 轴亢进、增加脑内单胺递质含量有关。

〔关键词 复方柴金解郁片;抑郁;慢性应激;HPA 轴;海马;单胺递质

〔中图分类号〕R285.5 〔文献标识码〕A 〔文章编号〕doi:10.3969/j.issn.1674-070X.2017.03.003


抑郁症是以情绪低落、兴趣丧失、思维迟缓为主要特征的精神性**,具有高发病、高复发、高**、高医疗成本的特点 现代医学研究认为,下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA 轴)是机体一个重要的***轴,海马是 HPA 轴负反馈的调节**,同时也是学习 记忆以及引起情感障碍的关键脑区,HPA 轴失调依赖性的海马神经元损伤是抑郁产生的主 要驱动力[1-2] 复方柴金解郁片(砖利授权号为 ZL20 1210126887.X)具有“疏肝**、**解郁”之功效 临床用于**轻、中度抑郁症,疗效显著 为了能更好地探明复方柴金解郁片的抗抑郁功效及其机制 本研究以慢性不可预见性应激抑郁模型大鼠为研究 对象 通过研究复方柴金解郁片对模型大鼠行为、HPA 轴指标促肾上腺皮质**释放**(CRH)、促肾上腺皮质**(ACTH)、皮质酮(CORT)以及海马单胺递质 5-羟色胺(5-HT)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)、去甲肾上腺素(NA)、多巴胺(DA)的调控作用,探讨其抗抑郁作用的机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级雄性 SD 大鼠 75 只,体质量 160~180 g 由北京维通利华实验动物有限公司提供 合格证号:No.11400700028228。许可证号:SCXK(湘) 2012-

0001 在光/暗周期为 12 h/12 h (光照时间 7:00~

19:00)的条件下饲养于笼中,自由饮水和摄食。

1.2 **

复方柴金解郁片浸膏粉,相当生药量为 6.6 g 生药/g(文中均按生药量计算)(由湖南中医药大学**附属医院药剂科提供,批号为 20121025) 复方柴金解郁片临床拟用**每日生药量为 20.5 g 盐酸氟西汀分散片,Patheon France 生产,批号 2860A。

1.3 试剂与主要仪器

    5 -HT、5 -HIAA、NA、DA、ACTH、CRH、CORT  酶联**试剂盒购自美国 R&D 公司;DB001 Morris 水迷宫购自北京智鼠多宝生物科技有限责任公司 MK3 型酶标仪购自美国 Thermo;ET-12P 组织脱水机购自江西富华生物技术有限公司;RM223 切片机购自德国莱卡公司;DVP-W7 显微镜图像处理系统购自南京民城信息系统公司。

1.4 分组与给药

所有大鼠适应性喂养 3 d 后进行蔗糖水消耗测试 选取蔗糖水摄入量相近的 72 只大鼠随机分为 6 组 包括正常对照组、抑郁模型组、氟西汀组

(5.4 mg/kg) 复方柴金解郁片高 低剂量组(2.74、1.37、0.68 g/kg) 造模同时灌胃给药 每日 1 次,连续 28 d,对照组、模型组则给予等体积的蒸馏水 末次给药结束后,所有大鼠进行行为学检测,检测完成后用水合氯醛将大鼠麻醉,腹主动脉取血,取大鼠下丘脑、垂体、肾上腺等组织固定于 10%甲醛溶液中,冷冻台上取海马组织,液氮速冻,保存待用。

1.5造模

     采用慢性不可预见性温和应激联合孤养建立抑郁大鼠模型[3],应激方法包括冰水浴 4 min、禁食或禁水 24 h、50 V 电击 3 min 倾笼 24 h 噪音


4 h、光照或黑暗 24 h、潮湿垫料 24 h、夹尾 1 min 每天采用 1~2 种刺激,同种刺激不连续出现,躯体应激每周限 1 次(电击、夹尾), 28 d,

期间动物均孤笼饲养。

1.6行为学测试

1.6.1 糖水偏嗜度 给药 28 d 后,禁食禁水 24 h 测定每组动物 4 h 内的 1 %蔗糖水偏嗜度 蔗糖偏嗜度=蔗糖水消耗量/( 蔗糖水消耗量+ 蒸馏水消耗量)×100%。

1.6.2 旷场实验 将大鼠放入高 40 cm,长宽为 80 cm 的测试敞箱,以大鼠在 3 min 内穿越底面次数为水平得分(四爪均进入方格),以直立次数为竖直得分(两前爪离开底面)。 记录大鼠水平得分和竖直得分的总和。

1.6.3 Morris 水迷宫实验 Morris 水迷宫操作系统:直径为 1.5 m 的圆形水池,平台直径为 0.15 m 水深 0.4 m,平台置于迷宫西南象限 水面高出平台3 cm,水温保持(24±1) ℃ 于第 23 天开始对各组大鼠进行水迷宫训练,训练 5 d,训练完成后记录大鼠爬上平台的潜伏期时间, 考查大鼠的学习能力;于第 28 天撤去平台,   记录大鼠进入平台所在象限的潜伏时间考察大鼠的记忆能。

1.7 HE 染色
  
取固定于 4%甲醛溶液中的组织 常规石蜡包埋,切片,薄片用二甲苯和各级乙醇切片脱蜡水洗 洗完后用苏木素染色 5 min,蒸馏水冲洗至干净,经盐酸乙醇分化和自来水浸泡后置伊红液中 2 min 纯酒精脱水,二甲苯使之变透明,用加拿大树胶封固,光学显微镜下观察待检测组织的病理情况。

1.8 ELISA 检测
 
往预先包被待测抗体的微孔中,依次加入标本、标准品、HRP 标记的检测抗体 经过温育并彻底洗涤 用底物 TMB 显色,TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色 并在酸的作用下转化成*终的黄色。颜色的深浅与各物质的含量呈正相关 用酶标仪在450 nm 波长下测定光密度值。
1.9 统计学分析


采用 SPSS 17.0 统计软件进行数据分析 数据“x±s”表示 采用 One-way-ANOVA 检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

结果

2.1 对抑郁大鼠糖水偏嗜度的影响

给药前(造模前),各组大鼠糖水偏嗜度无明显差异(P>0.05)。 28 d 造模结束后,与对照组比较,模型组大鼠糖水偏嗜度明显降低(P<0.01);与模型组比较,氟西汀组、复方柴金解郁片高、中剂量组大鼠糖水偏嗜度明显升高(P<0.01 P<0.05),结果见表 1。


2.2 对抑郁大鼠活动次数的影响

     与对照组比较,抑郁模型组大鼠自主活动次数显著下降(P<0.01) 与模型组比较,氟西汀组和复方柴金解郁片高剂量组大鼠总活动数明显增加 P<0.01);同时,中剂量的复方柴金解郁片也能使模型大鼠活动次数增加(P<0.05) 结果见表 2。

2.3 对抑郁大鼠学习记忆能力的影响

与对照组比较,模型组大鼠出现学习记忆障碍 表现为爬上平台潜伏期时间和进入目标象限所耗时 间均明显延长(P<0.01) 在给予氟西汀和高剂量的复方柴金解郁片后 大鼠学习和记忆能力均有所提升 表现为找到平台时间与进入目标象限时间均显著降低(P<0.01  P<0.05) 结果见表 2。



2.4 对抑郁大鼠血浆 ACTH、CRH、CORT 含量的影响与对照组比较  模型组大鼠血浆 ACTH、CRH、CORT 均明显升高(P<0.01)   与模型组比较,氟西汀组、复方柴金解郁片高剂量组大鼠 ACTH、CRH、CORT 含量均明显下降 (P<0.01 P<0.05);复方柴金解郁片中剂量组大鼠血浆 CORT 含量显著下降 (P<0.05)。结果见表 3。


2.5 对抑郁大鼠海马组织病理形态的影响

    如图 1 所示,正常大鼠海马椎体细胞排列整齐,形态规则,细胞间隙正常 模型组大鼠海马椎体细胞排列疏松,可见不同程度的胞体固缩,深染及空泡变性;给予氟西汀或高剂量复方柴金解郁片后,空泡细胞数量减少,细胞肿胀程度减轻,排列相对整齐 而中、低剂量的复方柴金解郁片对海马椎体细胞的保护作用较弱。

2.6  对抑郁大鼠海马组织内单胺神经递质的影响  与对照组比较,模型组大鼠海马  5-HT、NA、DA含量均明显降低  (P<0.01),5-HT 代谢产物 5-HIAA含量升高,两者比值也显著升高(P<0.01) 与模型组比较,高剂量复方柴金解郁片组 5-HT、NA、DA 含量均明显升高(P<0.05 或 P<0.01),5-HT 代谢率(5-HI- AA/5-HT)下降(P<0.01);中剂量复方柴金解郁片组5-HT 含量升高(P<0.05),5-HT 代谢率下降(P<0.05)。结果见表 4。













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